Penemuan virologi dapat mengubah biologi

2024 Pengarang: Seth Attwood | [email protected]. Terakhir diubah: 2023-12-16 16:08

Virus adalah makhluk kecil tapi “sangat kuat” yang tanpanya kita tidak akan bertahan hidup. Pengaruh mereka terhadap planet kita tidak dapat disangkal. Sangat mudah untuk menemukannya, para ilmuwan terus mengidentifikasi jenis virus yang sebelumnya tidak diketahui. Tapi seberapa banyak yang kita ketahui tentang mereka? Bagaimana kita tahu mana yang harus diselidiki terlebih dahulu?

Virus corona SARS-CoV-2 hanyalah satu dari beberapa juta virus yang hidup di planet kita. Para ilmuwan dengan cepat mengidentifikasi banyak jenis baru.

Maya Breitbart telah mencari virus baru di gundukan rayap Afrika, anjing laut Antartika, dan Laut Merah. Tapi, ternyata, untuk benar-benar menemukan sesuatu, dia hanya perlu melihat ke taman rumahnya di Florida. Di sana, di sekitar kolam, Anda dapat menemukan laba-laba orb-web dari spesies Gasteracantha cancriformis.

Mereka memiliki warna cerah dan tubuh putih bulat, di mana bintik hitam dan enam duri merah terlihat, mirip dengan senjata aneh dari Abad Pertengahan. Tapi di dalam tubuh laba-laba ini, Maya Brightbart terkejut: ketika Brightbart, seorang ahli ekologi virus di University of South Florida di St. tidak diketahui sains.

Seperti yang Anda ketahui, sejak tahun 2020, kita orang biasa hanya disibukkan dengan satu virus yang sangat berbahaya yang diketahui semua orang sekarang, tetapi masih banyak virus lain yang belum terdeteksi. Menurut para ilmuwan, sekitar 10³¹partikel virus yang berbeda, yang sepuluh miliar kali jumlah perkiraan bintang di alam semesta yang dapat diamati.

Sekarang jelas bahwa ekosistem dan organisme individu bergantung pada virus. Virus adalah makhluk kecil, tetapi sangat kuat, mereka mempercepat perkembangan evolusi selama jutaan tahun, dengan bantuan mereka, transfer gen antara organisme inang dilakukan. Hidup di lautan dunia, virus membedah mikroorganisme, membuang isinya ke lingkungan perairan dan memperkaya jaring makanan dengan nutrisi. “Kami tidak akan bertahan tanpa virus,” kata ahli virus Curtis Suttle dari University of British Columbia di Vancouver, Kanada.

Komite Internasional untuk Taksonomi Virus (ICTV) menemukan bahwa saat ini ada 9.110 jenis virus yang berbeda di dunia, tetapi ini jelas merupakan sebagian kecil dari totalnya. Hal ini sebagian disebabkan oleh fakta bahwa klasifikasi resmi virus di masa lalu mengharuskan para ilmuwan untuk membudidayakan virus dalam organisme inang atau selnya; proses ini memakan waktu dan terkadang tampak rumit secara tidak realistis.

Alasan kedua adalah bahwa dalam penelitian ilmiah, penekanannya adalah pada penemuan virus-virus yang menyebabkan penyakit pada manusia atau organisme hidup lain yang bernilai tertentu bagi manusia, misalnya, menyangkut hewan ternak dan tanaman.

Namun demikian, seperti yang diingatkan oleh pandemi covid-19, penting untuk mempelajari virus yang dapat ditularkan dari satu organisme inang ke organisme inang lainnya, dan ini justru menjadi ancaman bagi manusia, juga hewan peliharaan atau tanaman.

Selama dekade terakhir, jumlah virus yang diketahui telah meroket karena peningkatan teknologi deteksi, dan juga karena perubahan baru-baru ini dalam aturan untuk mengidentifikasi jenis virus baru, yang memungkinkan untuk mendeteksi virus tanpa perlu membudidayakannya dengan organisme inang.

Salah satu metode yang paling umum adalah metagenomics. Ini memungkinkan para ilmuwan untuk mengumpulkan sampel genom dari lingkungan tanpa perlu mengolahnya. Teknologi baru seperti pengurutan virus telah menambahkan lebih banyak nama virus ke dalam daftar, termasuk beberapa yang secara mengejutkan tersebar luas tetapi sebagian besar masih tersembunyi dari para ilmuwan.

“Sekarang adalah waktu yang tepat untuk melakukan penelitian semacam ini,” kata Maya Brightbart. - Saya pikir dalam banyak hal sekarang adalah waktu untuk virome [virome - kumpulan semua virus yang merupakan ciri khas organisme individu - kira-kira Terjemahan.] ".

Pada tahun 2020 saja, ICTV menambahkan 1.044 spesies baru ke daftar virus resminya, dengan ribuan virus lainnya menunggu deskripsi dan sejauh ini tidak disebutkan namanya. Munculnya berbagai macam genom mendorong ahli virologi untuk memikirkan kembali cara virus diklasifikasikan dan membantu memperjelas proses evolusinya. Ada bukti kuat bahwa virus tidak berasal dari satu sumber, tetapi terjadi beberapa kali.

Namun ukuran sebenarnya dari komunitas virus global sebagian besar tidak diketahui, menurut ahli virologi Jens Kuhn dari Institut Nasional Alergi dan Penyakit Menular (NIAID) AS di Fort Detrick, Maryland: “Kami benar-benar tidak tahu bahwa itu sedang terjadi."

Di mana-mana dan di mana-mana

Setiap virus memiliki dua sifat: pertama, genom setiap virus terbungkus dalam lapisan protein, dan kedua, setiap virus menggunakan organisme inang asing - baik itu manusia, laba-laba, atau tanaman - untuk tujuan reproduksinya. Tetapi ada variasi yang tak terhitung jumlahnya dalam skema umum ini.

Misalnya, circovirus kecil hanya memiliki dua atau tiga gen, sedangkan mimivirus besar, yang lebih besar dari beberapa bakteri, memiliki ratusan gen.

Misalnya, ada bakteriofag yang agak mirip dengan alat untuk mendarat di bulan - bakteriofag ini menginfeksi bakteri. Dan, tentu saja, saat ini semua orang tahu tentang bola pembunuh yang ditumbuhi duri, gambar-gambar yang sekarang mungkin sangat akrab bagi setiap orang di negara mana pun di dunia. Dan virus juga memiliki fitur ini: satu kelompok virus menyimpan genomnya dalam bentuk DNA, sedangkan yang lain - dalam bentuk RNA.

Bahkan ada bakteriofag menggunakan alfabet genetik alternatif, di mana basa nitrogen A dalam sistem ACGT kanonik digantikan oleh molekul lain yang ditunjuk oleh huruf Z [huruf A adalah singkatan dari basa nitrogen "adenin", yang merupakan bagian dari nukleat asam (DNA dan RNA); ACGT- basa nitrogen yang menyusun DNA, yaitu: A - adenin, C - sitosin, G - guanin, T - timin, - kira-kira. terjemahan].

Virus ada di mana-mana dan usil sehingga mereka dapat muncul bahkan jika para ilmuwan tidak mencarinya. Jadi, misalnya, Frederik Schulz tidak berniat mempelajari virus sama sekali, bidang penelitian ilmiahnya adalah urutan genom dari air limbah. Sebagai mahasiswa pascasarjana di Universitas Wina, Schultz menggunakan metagenomik untuk menemukan bakteri pada tahun 2015. Dengan pendekatan ini, para ilmuwan mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggilingnya menjadi potongan-potongan kecil, dan mengurutkannya. Kemudian program komputer merakit genom individu dari potongan-potongan ini. Prosedur ini mengingatkan pada perakitan beberapa ratus teka-teki sekaligus dari fragmen terpisah yang dicampur satu sama lain.

Di antara genom bakteri, Schultz tidak bisa tidak memperhatikan sebagian besar genom virus (tampaknya karena potongan ini memiliki gen amplop virus), yang mencakup 1,57 juta pasangan basa. Genom virus ini ternyata raksasa, merupakan bagian dari kelompok virus, yang anggotanya adalah virus raksasa baik dalam ukuran genom maupun dalam dimensi absolut (biasanya berdiameter 200 nanometer atau lebih). Virus ini menginfeksi amuba, alga dan protozoa lainnya, sehingga mempengaruhi ekosistem perairan, serta ekosistem di darat.

Frederick Schultz, sekarang seorang ahli mikrobiologi di Institut Genom Bersama Departemen Energi AS di Berkeley, California, memutuskan untuk mencari virus terkait dalam basis data metagenomik. Pada tahun 2020, dalam artikel mereka, Schultz dan rekan-rekannya menggambarkan lebih dari dua ribu genom dari kelompok yang berisi virus raksasa. Ingatlah bahwa sebelumnya, hanya 205 genom seperti itu yang dimasukkan dalam database yang tersedia untuk umum.

Selain itu, ahli virologi juga harus melihat ke dalam tubuh manusia untuk mencari spesies baru. Spesialis bioinformatika virus Luis Camarillo-Guerrero, bersama dengan rekan-rekannya dari Institut Senger di Hinkston (Inggris), menganalisis metagenom usus manusia dan membuat database yang berisi lebih dari 140.000 spesies bakteriofag. Lebih dari setengahnya tidak diketahui sains.

'Studi bersama para ilmuwan, yang diterbitkan pada bulan Februari, bertepatan dengan temuan ilmuwan lain bahwa salah satu kelompok virus paling umum yang menginfeksi bakteri usus manusia adalah kelompok yang dikenal sebagai crAssphage (dinamai dari program cross-assembler yang menemukannya pada 2014). Terlepas dari banyaknya virus yang terwakili dalam kelompok ini, para ilmuwan hanya tahu sedikit tentang bagaimana virus dari kelompok ini berpartisipasi dalam mikrobioma manusia, kata Camarillo-Guerrero, yang sekarang bekerja untuk perusahaan pengurutan DNA Illumina (Illumina berlokasi di Cambridge, Inggris).

Metagenomics telah menemukan banyak virus, tetapi pada saat yang sama, metagenomics mengabaikan banyak virus. Dalam metagenom tipikal, virus RNA tidak diurutkan, jadi ahli mikrobiologi Colin Hill dari Universitas Nasional Irlandia di Cork, Irlandia, dan rekan-rekannya mencari mereka di database RNA yang disebut metatranskrip.

Para ilmuwan biasanya mengacu pada data ini ketika mempelajari gen dalam suatu populasi, mis. gen-gen yang secara aktif diubah menjadi messenger RNA [messenger RNA (atau mRNA) juga disebut messenger RNA (mRNA) - kira-kira. terjemahan] terlibat dalam produksi protein; tetapi genom virus RNA juga dapat ditemukan di sana. Menggunakan teknik komputasi untuk mengekstrak urutan dari data, tim menemukan 1.015 genom virus dalam metatrancryptomes dari sampel lumpur dan air. Berkat kerja para ilmuwan, informasi tentang virus yang diketahui telah meningkat secara signifikan setelah hanya satu artikel yang muncul.

Berkat metode ini, dimungkinkan untuk secara tidak sengaja mengumpulkan genom yang tidak ada di alam, tetapi untuk mencegahnya, para ilmuwan telah belajar menggunakan metode kontrol. Tapi ada juga kelemahan lainnya. Misalnya, sangat sulit untuk mengisolasi jenis virus tertentu dengan keragaman genetik yang besar, karena program komputer sulit untuk menyatukan urutan gen yang berbeda.

Pendekatan alternatif adalah mengurutkan setiap genom virus secara terpisah, seperti yang dilakukan oleh ahli mikrobiologi Manuel Martinez-Garcia dari Universitas Alicante di Spanyol. Setelah melewati air laut melalui filter, ia mengisolasi beberapa virus tertentu, memperkuat DNA mereka dan melanjutkan ke sekuensing.

Setelah percobaan pertama, ia menemukan 44 genom. Ternyata salah satunya adalah jenis salah satu virus paling umum yang hidup di lautan. Virus ini memiliki keragaman genetik yang begitu besar (yaitu, fragmen genetik partikel virusnya sangat berbeda dalam partikel virus yang berbeda) sehingga genomnya tidak pernah muncul dalam penelitian metagenomik. Para ilmuwan menamakannya "37-F6" karena lokasinya di piring laboratorium. Namun, Martinez-Garcia bercanda, mengingat kemampuan genom untuk bersembunyi di depan mata, seharusnya diberi nama 007 setelah agen super James Bond.

Pohon keluarga virus

Virus laut seperti itu, sama rahasianya dengan James Bond, tidak memiliki nama Latin resmi, seperti halnya sebagian besar dari beberapa ribu genom virus yang ditemukan selama dekade terakhir menggunakan metagenomics. Urutan genom ini menimbulkan pertanyaan sulit bagi ICTV: Apakah satu genom cukup untuk menamai virus? Hingga 2016, urutan berikut ada: jika para ilmuwan mengusulkan jenis virus atau kelompok taksonomi baru untuk ICTV, maka, dengan pengecualian yang jarang, perlu untuk menyediakan tidak hanya virus ini, tetapi juga organisme inang dalam kultur. Namun pada 2016, setelah perdebatan sengit, para ahli virologi sepakat bahwa satu genom saja sudah cukup.

Aplikasi untuk virus baru dan kelompok virus mulai berdatangan. Tetapi hubungan evolusi antara virus-virus ini terkadang tetap tidak jelas. Ahli virologi biasanya mengklasifikasikan virus berdasarkan bentuknya (misalnya, "panjang", "tipis", "kepala dan ekor") atau berdasarkan genomnya (DNA atau RNA, untai tunggal atau ganda), tetapi sifat-sifat ini memberi tahu kita sedikit. tentang asal usul mereka yang sama. Misalnya, virus dengan genom DNA untai ganda tampaknya berasal dari setidaknya empat situasi berbeda.

Klasifikasi awal virus ICTV (yang menyiratkan bahwa pohon virus dan pohon bentuk kehidupan seluler ada secara terpisah satu sama lain) hanya mencakup langkah-langkah hierarki evolusioner yang lebih rendah, mulai dari spesies dan genera hingga tingkat yang, menurut klasifikasi kehidupan multiseluler, setara dengan primata atau tumbuhan runjung. Tidak ada tingkat yang lebih tinggi dari hierarki evolusi virus. Dan banyak keluarga virus hidup dalam isolasi, tanpa hubungan dengan jenis virus lain. Jadi, pada tahun 2018, ICTV menambahkan tingkat urutan yang lebih tinggi untuk mengklasifikasikan virus: kelas, jenis, dan ranah.

Di bagian paling atas klasifikasi virus ICTV menempatkan kelompok yang disebut "alam" (alam), yang merupakan analog dari "domain" untuk bentuk kehidupan seluler (bakteri, archaea dan eukariota), yaitu. ICTV menggunakan kata yang berbeda untuk membedakan kedua pohon tersebut. (Beberapa tahun yang lalu, beberapa ilmuwan menyarankan bahwa beberapa virus mungkin dapat masuk ke dalam pohon bentuk kehidupan seluler; tetapi gagasan ini belum mendapat persetujuan luas.)

ICTV telah menguraikan cabang-cabang pohon virus dan menetapkan virus RNA ke wilayah yang disebut Riboviria; omong-omong, bagian dari area ini adalah virus SARS-CoV-2 dan virus corona lainnya, yang genomnya adalah RNA untai tunggal. Tetapi kemudian komunitas besar ahli virologi harus mengusulkan kelompok taksonomi tambahan. Kebetulan ahli biologi evolusi Eugene Koonin dari Pusat Nasional Informasi Bioteknologi di Bethesda, Maryland, mengumpulkan tim ilmuwan untuk menemukan cara pertama untuk mengkategorikan virus. Untuk tujuan ini, Kunin memutuskan untuk menganalisis semua genom virus, serta hasil penelitian tentang protein virus.

Mereka mengatur ulang wilayah Riboviria dan mengusulkan tiga alam lagi. Ada kontroversi mengenai beberapa detail, kata Kunin, tetapi pada tahun 2020 sistematisasi disetujui oleh anggota ICTV tanpa banyak kesulitan. Dua alam lagi diberi lampu hijau pada tahun 2021, menurut Kunin, tetapi empat alam yang asli kemungkinan akan tetap menjadi yang terbesar. Pada akhirnya, Kunin menyarankan, jumlah alam bisa mencapai 25.

Jumlah ini mengkonfirmasi kecurigaan banyak ilmuwan: virus tidak memiliki nenek moyang yang sama. “Tidak ada nenek moyang tunggal untuk semua virus,” kata Kunin. "Itu tidak ada." Ini berarti bahwa virus kemungkinan telah muncul beberapa kali sepanjang sejarah kehidupan di Bumi. Jadi, kami tidak punya alasan untuk mengatakan bahwa virus tidak dapat muncul lagi. “Virus baru terus muncul di alam,” kata ahli virus Mart Krupovic dari Institut Pasteur di Paris, yang telah terlibat dalam pengambilan keputusan ICTV dan penelitian kelompok Kunin tentang sistematisasi.

Ahli virologi memiliki beberapa hipotesis tentang penyebab alam. Mungkin alam berasal dari elemen genetik independen pada awal kehidupan di planet Bumi, bahkan sebelum sel terbentuk. Atau mungkin mereka meninggalkan seluruh sel, "melarikan diri" dari mereka, meninggalkan sebagian besar mekanisme seluler untuk mempertahankan keberadaan mereka pada tingkat minimum. Kunin dan Krupovich mendukung hipotesis hibrida, yang menurutnya elemen genetik primer ini "mencuri" materi genetik dari sel untuk membangun partikel virus. Karena ada banyak hipotesis tentang asal usul virus, sangat mungkin ada banyak cara kemunculannya, kata ahli virologi Jens Kuhn, yang bekerja di komite ICTV pada proposal untuk sistematisasi virus yang baru.

Terlepas dari kenyataan bahwa pohon virus dan seluler berbeda, cabangnya tidak hanya bersentuhan, tetapi juga bertukar gen. Jadi di mana virus harus diklasifikasikan - hidup atau mati? Jawabannya tergantung pada bagaimana Anda mendefinisikan "hidup". Banyak ilmuwan tidak menganggap virus sebagai makhluk hidup, sementara yang lain tidak setuju. "Saya cenderung percaya mereka hidup," kata ilmuwan bioinformatika Hiroyuki Ogata, yang meneliti virus di Universitas Kyoto di Jepang. “Mereka berevolusi, mereka memiliki materi genetik yang terbuat dari DNA dan RNA. Dan mereka adalah faktor yang sangat penting dalam evolusi semua makhluk hidup."

Klasifikasi saat ini diterima secara luas dan merupakan upaya pertama untuk menggeneralisasi berbagai virus, meskipun beberapa ahli virologi percaya bahwa itu agak tidak tepat. Selusin keluarga virus masih tidak memiliki hubungan dengan ranah mana pun. “Kabar baiknya adalah kami mencoba untuk mengatur setidaknya beberapa kekacauan ini,” tambah ahli mikrobiologi Manuel Martinez-Garcia.

Mereka mengubah dunia

Total massa virus yang hidup di Bumi setara dengan 75 juta paus biru. Para ilmuwan yakin bahwa virus memengaruhi jaring makanan, ekosistem, dan bahkan atmosfer planet kita. Menurut spesialis virologi lingkungan Matthew Sullivan dari Ohio State University di Columbus, para ilmuwan semakin menemukan jenis virus baru, dengan para peneliti "menemukan cara yang sebelumnya tidak diketahui di mana virus memiliki dampak langsung pada ekosistem." Para ilmuwan sedang mencoba untuk mengukur paparan virus ini.

“Saat ini kami tidak memiliki penjelasan sederhana untuk fenomena yang terjadi,” kata Hiroyuki Ogata.

Di lautan dunia, virus dapat meninggalkan mikroba inangnya, melepaskan karbon, yang akan didaur ulang oleh makhluk lain yang memakan bagian dalam mikroba inang ini dan kemudian melepaskan karbon dioksida. Tetapi baru-baru ini, para ilmuwan juga sampai pada kesimpulan bahwa sel-sel yang meledak sering kali menggumpal dan tenggelam ke dasar lautan dunia, mengikat karbon dari atmosfer.

Mencairnya lapisan es di darat adalah sumber utama pembentukan karbon, kata Matthew Sullivan, dan virus tampaknya membantu melepaskan karbon dari mikroorganisme di lingkungan ini. Pada tahun 2018, Sullivan dan rekan-rekannya menggambarkan 1.907 genom virus dan fragmennya yang dikumpulkan selama pencairan permafrost di Swedia, termasuk gen untuk protein yang entah bagaimana dapat memengaruhi proses peluruhan senyawa karbon dan, mungkin, proses transformasinya menjadi gas rumah kaca..

Virus juga dapat mempengaruhi organisme lain (misalnya, mengacak genom mereka). Misalnya, virus membawa gen untuk resistensi antibiotik dari satu bakteri ke bakteri lain, dan strain yang resistan terhadap obat akhirnya bisa menang. Menurut Luis Camarillo-Guerrero, seiring waktu, transfer gen semacam itu dapat menyebabkan perubahan evolusioner yang serius pada populasi tertentu - dan tidak hanya pada bakteri. Jadi, menurut beberapa perkiraan, 8% DNA manusia berasal dari virus. Jadi, misalnya, dari virus nenek moyang mamalia kita menerima gen yang diperlukan untuk perkembangan plasenta.

Para ilmuwan akan membutuhkan lebih dari sekadar genom mereka untuk memecahkan banyak pertanyaan tentang perilaku virus. Hal ini juga diperlukan untuk menemukan host virus. Dalam hal ini, petunjuk dapat disimpan di dalam virus itu sendiri: virus, misalnya, dapat berisi fragmen yang dapat dikenali dari materi genetik inang dalam genomnya sendiri.

Ahli mikrobiologi Manuel Martinez-Garcia dan rekan telah menggunakan genomik sel tunggal untuk mengidentifikasi mikroba yang mengandung virus 37-F6 yang baru ditemukan. Organisme inang dari virus ini adalah bakteri Pelagibacter, yang merupakan salah satu organisme laut yang paling luas dan beragam. Di beberapa wilayah lautan di dunia, Pelagibacter menyumbang hampir setengah dari semua sel yang hidup di perairannya. Jika virus 37-F6 tiba-tiba menghilang, lanjut Martinez-Garcia, kehidupan organisme akuatik akan sangat terganggu.

Para ilmuwan perlu mencari tahu bagaimana ia mengubah inangnya untuk mendapatkan gambaran lengkap tentang dampak virus tertentu, jelas ahli ekologi evolusioner Alexandra Worden dari Ocean Science Center. Helmholtz (GEOMAR) di Kiel, Jerman. Warden sedang mempelajari virus raksasa yang membawa gen untuk protein fluoresen yang disebut rhodopsin.

Pada prinsipnya, gen ini juga dapat berguna untuk organisme inang, misalnya, untuk tujuan seperti mentransfer energi atau mentransmisikan sinyal, tetapi fakta ini belum dikonfirmasi. Untuk mengetahui apa yang terjadi pada gen rhodopsin, Alexandra Vorden berencana untuk membudidayakan organisme inang (host) bersama-sama dengan virus untuk mempelajari mekanisme kerja pasangan ini (host-virus), disatukan menjadi satu kompleks. - "virocell".

"Hanya melalui biologi sel Anda dapat mengetahui apa peran sebenarnya dari fenomena ini dan bagaimana tepatnya hal itu mempengaruhi siklus karbon," tambah Warden.

Di rumahnya di Florida, Maya Brightbart tidak membudidayakan virus yang diisolasi dari laba-laba Gasteracantha cancriformis, tetapi dia berhasil mempelajari satu atau dua hal tentang mereka. Dua virus yang sebelumnya tidak diketahui ditemukan pada laba-laba ini termasuk dalam kelompok yang oleh Brightbart digambarkan sebagai "luar biasa" - dan semua karena genom kecil mereka: yang pertama mengkodekan gen untuk mantel protein, yang kedua - gen untuk protein replikasi.

Karena salah satu virus ini hanya ada di tubuh laba-laba, tetapi tidak di kakinya, Brightbart percaya bahwa sebenarnya fungsinya adalah menginfeksi mangsa, yang kemudian dimakan oleh laba-laba. Virus kedua dapat ditemukan di berbagai area tubuh laba-laba - di cengkeraman telur dan keturunannya - sehingga Brightbart percaya bahwa virus ini ditularkan dari induk ke keturunannya. Menurut Brightbart, virus ini tidak berbahaya bagi laba-laba.

Jadi virus "sebenarnya yang paling mudah ditemukan," kata Maya Brightbart. Jauh lebih sulit untuk menentukan mekanisme bagaimana virus mempengaruhi siklus hidup dan ekologi organisme inang. Tetapi pertama-tama, ahli virologi harus menjawab salah satu pertanyaan paling sulit, Brightbart mengingatkan kita: "Bagaimana kita tahu mana yang harus diselidiki sejak awal?"